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北京立博泰業(yè)科技有限公司
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更新時間:2025-01-06 21:24:18瀏覽次數(shù):39次
聯(lián)系我時,請告知來自 紡織服裝機(jī)械網(wǎng)(貨號:WLRE5003)原理概述:本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù):在常溫恒溫下,特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈,反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)
(貨號:WLRE5003)
原理概述:
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù):在常溫恒溫下,特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈,反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)。本試劑盒在42 oC下,依賴核酸外切酶的作用,加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針,使用熒光監(jiān)測設(shè)備能實現(xiàn)對目標(biāo)片段擴(kuò)增過程的實時監(jiān)控。適用于實驗室級別的RNA擴(kuò)增以及其他檢測用途的RNA擴(kuò)增使用。
引物設(shè)計:
建議使用長度在30-35 bp的引物,引物過短會影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度;引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增;擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp,通常不超過500 bp。
熒光探針設(shè)計:
探針序列不與特異性引物識別位點重疊,長度為46-52 nt,序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四個修飾位點:距離5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個dSpacer(四氫呋喃,THF),作為核酸外切酶的識別位點;THF位點的上游標(biāo)記一個熒光基團(tuán),下游標(biāo)記一個粹滅基團(tuán),兩個基團(tuán)的間距為2-4 nt;THF距離3’末端≥15 nt,并且3’末端標(biāo)記一個修飾基團(tuán),例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer。
試劑盒組成:
100T/盒
組成 | 含量 |
C buffer | 1 mL×2管 |
L buffer | 500 μL×1管 |
P-core | 1.2 mL×1管 |
E-core | 60 μL×1管 |
B buffer | 300 μL×1管 |
使用說明書 | 1份 |
試劑盒儲存:
運輸條件:低溫運輸;
儲存條件:儲存溫度 ≤ -20 oC,避光保存,避免重壓、反復(fù)凍融;
操作步驟:提前將試劑盒所需組分取出,冰上或低溫下融化(C buffer可室溫融化),震蕩混勻。
1) 向無菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer;
2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針,再加入1.5μL dNTPs(10 mM);
3) 向反應(yīng)管中加入12 μL P-core和0.6 μL E-core,(步驟1~3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中);
4) 向反應(yīng)管中加入3.8 μL核酸模板;
5) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合(加入B buffer反應(yīng)立即被啟動);混勻后,將反應(yīng)液甩(或快速離心)至管子底部,然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測設(shè)備中。熒光檢測程序設(shè)置為:恒溫42 oC;每30 s采集一次熒光信號;反應(yīng)時間20 mins。
注:如使用ABI系列PCR儀,請務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none"。
體系配制
組分 | 體積(μL) |
C buffer | 20
5 |
L buffer | |
P-core | 12 |
E-core | 0.6 |
dNTPs(10 mM) | 1.5 |
下游引物(10 μM) | 2 |
下游引物(10 μM) | 2 |
探針(10 μM) | 0.6 |
DNA模板 | 3.8 |
B buffer | 2.5 |
總體積 | 50 |
N:陰性對照; P:正對照 |
注意事項:
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