（貨號(hào)：WLRN8209KIT）原理概述：本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)

詳細(xì)介紹

（貨號(hào)：WLRN8209KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需12 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。

本試劑對(duì)設(shè)備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無需購買PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。

引物設(shè)計(jì)：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)（常用）。引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp。

熒光探針設(shè)計(jì)：

在上下游引物中間，設(shè)計(jì)一段長度為46-52nt與目的片段互補(bǔ)的序列；5’端修飾一個(gè)抗原標(biāo)記（典型FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識(shí)別位點(diǎn)；3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer等。

試劑盒組成：

組成	含量
A buffer	1.6 mL×1管
B buffer	150 μL×1管
試劑	48份
使用說明書	1份

試劑盒儲(chǔ)存：

運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；

儲(chǔ)存條件：建議儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓和反復(fù)凍融；

產(chǎn)品有效期：14個(gè)月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1) 每個(gè)干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；

2) 每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對(duì)于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3) 向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為13.5 μL）；

4) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請(qǐng)務(wù)必上下顛倒甩動(dòng)反應(yīng)管8-10次進(jìn)行混勻；對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)上下顛倒后混勻）；

5) 混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中42 oC孵育8-12 mins；

6) 反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH₂O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 mins內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測線判讀結(jié)果。

體系配制

組分	體積（μL）
A buffer	29.4
上游引物(10 μM)	2
下游引物(10 μM)	2
探針(10 μM)	0.6
ddH₂O和核酸模板	13.5
B buffer	2.5
總體積	50

注意事項(xiàng)：

1．由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免核酸污染，并設(shè)置空白對(duì)照；

2．使用時(shí)請(qǐng)取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，剩余部分請(qǐng)置于存儲(chǔ)條件下。

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