“兩蟲" (賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲)檢測

賈第鞭毛蟲是感染小腸的雙核鞭毛原生動物寄生蟲。感染通常會導(dǎo)致慢性虛弱的腹瀉，體重減輕和吸收不良。飲用被污染的水可能會導(dǎo)致賈第鞭毛蟲病。傳播也通過直接接觸而發(fā)生，尤其是與無癥狀的攜帶者接觸以及食物污染。高風(fēng)險類別包括幼兒，免疫功能低下的患者以及以前沒有接觸過的患者。

隱孢子蟲是脊椎動物的原生動物寄生蟲。在世界. 上大多數(shù)地區(qū),它與腹瀉病有關(guān)，是旅行者腹瀉的常見原因。該疾病是由厚壁卵囊傳播的，該卵囊對普通消毒劑和飲用水的常規(guī)氯化反應(yīng)具有顯著抵抗力。人與人之間的傳播很普遍。隱孢子蟲病是獲得性免疫缺陷綜合癥患者的一一種嚴(yán)重機會性感染。臨床表現(xiàn)包括腹瀉，腹痛，，嘔吐和體重減輕。在健康人中， 感染通常是自限性的。

在艾滋病和免疫抑制患者中，該病可能會持續(xù)時間延長并可能會危及生命。目前“兩蟲"已被列入國標(biāo)GB/T 5749- 2006非常規(guī)檢測項目。國標(biāo)GB/T 5750-2006中檢測方法源于EPA1623。方法流程為水樣過濾淘洗、免疫磁分離、熒光染色和鏡檢。在水樣的過濾淘洗步驟中，國標(biāo)描述了三種方法可選，其中Envirochek過濾淘洗方法為仲裁法。

北京格維恩科技有限公司作為PALL“兩蟲"檢測產(chǎn)品(Envirochek濾器、 多樣品洗脫振蕩器及試劑)國內(nèi)總代理，十幾年來與國內(nèi)疾控、環(huán)保、水務(wù)、第三方檢測、食藥監(jiān)、海關(guān)、高校及研究院合作開展“兩蟲"檢測項目，客戶數(shù)量過百家。同時提供EPA1623.1方法(2012年改進版本、針對含有磁性物質(zhì)的復(fù)雜水樣顯著提高回收率)供客戶選擇。

水樣過濾易于使用。無需組裝或清潔過濾器架或洗脫設(shè)備。

可同時處理多份樣品，節(jié)省時間。

一次性成品，可避免交叉污染和假陽性結(jié)果。

一般能夠回收70%以_ 上的靶標(biāo)生物。

濾膜孔徑小至1 um,能夠保留隱孢子蟲和賈地鞭毛蟲。

所有EnvirochekHV囊式采樣濾器均經(jīng)過完整性試驗。

使用安全。無需處理或拆分可能受到污染的濾芯。

各囊式濾器均分別帶有序列號,便于追溯。

Envirochek囊式采樣濾器已獲美國EPA方法1622和1623.1確認(rèn)與注冊。

Envirochek HV囊式采樣濾器專用于1,000 L或更多凈化水，經(jīng)確認(rèn)可用于50 L源水。

Envirochek HV囊式采樣濾器(產(chǎn) 品編號: 12096和12097) 通過了英國DWI成品水監(jiān)管測試。

Envirochek囊式采樣濾器已在ISO/DIS 15553-2006中注冊。

水樣淘洗:PALL專用的洗脫振蕩器可以同時洗脫8個樣品，15分鐘即可完成。設(shè)備操作簡單,不需要維護、清洗、消毒及額外的輔助設(shè)備如氣泵等。設(shè)備可靠性強，正常使用情況下，三年內(nèi)儀器出現(xiàn)硬件問題免費換新。

免疫磁分離IMS:利用DynalBead帶有特異性的“ 兩蟲"抗體磁珠與樣本中目標(biāo)蟲體抗原結(jié)合從而高效選擇性分離。

染色鏡檢利用BTF生產(chǎn)的Easystain染色試劑盒，內(nèi)含配制好的FIFC及DAPI染液及配套試劑，無需復(fù)染，染色效果、操作簡單。鏡檢配置專用的研究級正置熒光顯微鏡，同時擁高像素圖像采集系統(tǒng)。圖像清晰，可保存。熒光模塊、物鏡等均可拓展。滿足客戶多種需求。

“兩蟲"檢測方法及系統(tǒng)介紹

我公司推薦使用的Envirochek“兩蟲"檢測方法是GB5749-2006國標(biāo)和GB/T5750-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測方法》中測定生活飲用水和水源水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的方法，也是GB/T5750-2006國標(biāo)規(guī)定的兩蟲檢測的仲裁法，同時也是美國EPA制定的測定水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的標(biāo)準(zhǔn)方法EPA1623 (EPA-821-R-99-66)。

賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲簡述

1. 隱孢子蟲的生活史

隱孢子蟲（Cryptosporidium）是一種寄生性的原生動物，其中感染人的是微小隱孢子蟲C. parvum。

隱孢子蟲的卵囊呈圓形，直徑約4~6微米，成熟卵囊內(nèi)含4個呈月牙形的子孢子和呈顆粒物狀的殘留體。

隱孢子蟲的生活周期包括無性生殖、有性生殖和孢子生殖三個階段，可在同一宿主體內(nèi)完成。隨宿主糞便排出的卵囊(oocyts)具有感染性，新宿主吞食了存在于水中的卵囊就會感染隱孢子蟲病。隱孢子蟲整個生活周期約需5~11天。

2. 賈第鞭毛蟲的生活史

賈第氏鞭毛蟲（Giardia）是一種寄生性的原生動物，感染人的是腸賈第鞭毛蟲G.intestinalis。

孢囊呈橢圓形，長約8~18微米，寬約5~15微米，未成熟的孢囊有2個核，成熟的孢囊具4個核。

其生活史由孢囊和滋養(yǎng)體兩個不同的發(fā)育階段組成。

由于賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲卵囊和孢囊的表面包裹著一層較厚的囊壁，因此具有非常強的環(huán)境抗性。常規(guī)消毒工藝的氯濃度不能有效滅活隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲，它們通過水廠構(gòu)筑物進入供水管網(wǎng)，威脅人們健康。傳統(tǒng)檢測手段有嚴(yán)重的滯后性，不能及時準(zhǔn)確的報告水中有關(guān)兩蟲的信息。

3. 兩蟲的危害

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲產(chǎn)生的卵囊和孢囊對環(huán)境有很大的抗性，人體只要攝入幾個就會生病。

賈第鞭毛蟲致病劑量為10~100個活孢囊，隱孢子蟲致病劑量僅為1~10個活卵囊。

主要感染方式：主要通過患病動物糞便中的卵囊污染食物和飲用水而感染人畜。

主要易感人群為：兒童、老人或免疫力低下的人群。

發(fā)病癥狀：頭暈、、腹痛、嘔吐、腹瀉、低燒甚至死亡等。

1993年美國Wisconsim州Milwaukee市兩蟲污染事件導(dǎo)致了約40萬人受到感染，其中160多人死亡。

1998年夏，悉尼自來水公司在管網(wǎng)中檢出了高濃度的孢囊和卵囊，要求用戶將水煮沸后飲用，持續(xù)時間長達35天。

1997年美國對各水廠原水的月度調(diào)查表明：卵囊的高陽性檢出率為10.4%，孢囊的高陽性檢出率為31.3%。

德國有83%的水樣中檢測出有兩蟲，馬來西亞有90%檢出，香港有99%檢出，甚至在濾后水中也檢測出兩蟲。

美國國家于1997年7月~1998年12月調(diào)查結(jié)果顯示，4.62%~10.43%的水廠原水中有隱孢子蟲，而13.6%~31.25%的水廠原水中有賈第鞭毛蟲。在亞洲、非洲及拉丁美洲，每年有2.5~5億人次受到兩蟲感染。

“EPA1623方法"概述

1. 美國EPA于1996年12月起草，于1999年1月修正并通過測定隱孢子蟲的1622(EPA-821-R-99-001)方法，在此基礎(chǔ)上能同時測定隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的1623 (EPA-821-R-99-66)方法于1999年4月被批準(zhǔn)進行樣本分析。

2. EPA1623 方法中主要推薦并在實驗中采用的是Pall公司的Envirochek濾器。

3. 為了保障飲用水安全，實施優(yōu)質(zhì)供水，國家建設(shè)部在2005年6月1日正式實施的《城市供水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（CJ/T 206-2005）中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的微生物指標(biāo)。要求：<1個/10升水。

4. 在2006年12月29日發(fā)布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749-2006）中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的微生物指標(biāo)。要求：<1個/10升水。在實驗方法的淘洗/濃縮部分,首先推薦了Envirochek方法(Pall公司)，供選的還有Filta-Max方法和Filta-MaxXpress快速法。

5. Envirochek方法(Pall公司)作為國標(biāo)的方法，同時也是國標(biāo)規(guī)定的仲裁方法。

6. 為了完成國標(biāo)的檢測要求，開展行之有效的“兩蟲"檢測工作，建立“兩蟲"檢測實驗室勢在必行。我國一些供水企業(yè)和研究部門已經(jīng)開始了這方面的工作。

7. 目前國內(nèi)已經(jīng)建立“兩蟲"檢測系統(tǒng)的城市有天津、太原、深圳、東營、北京、大慶、南京、昆明、濟南、廈門、重慶、中山、廣州、青島、杭州、佛山、南寧、成都、株洲、上海、無錫、長沙等等，其中除廣深等早期自建實驗室之外，其余90%以上的“兩蟲"檢測系統(tǒng)均是由北京格維恩公司和廣州格維恩公司設(shè)計實施的。 

 “EPA1623方法"內(nèi)容簡述

一、方法概述

1. 本方案是通過對過濾、免疫磁分離（IMS）和免疫檢驗化驗（FA）顯微鏡等方法來確定水中的隱孢子蟲(CAS登記號137259-0-8)和賈第鞭毛蟲（CAS登記號137259-49-5）的特性與濃度，隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲可以通過4'，6-Diamidino-Phenylindole(DAPI)著色和差分干涉相襯（DIC）顯微鏡檢驗法進行確定。本方案經(jīng)批準(zhǔn)可用于地表水，但如果實驗室證明符合該方案執(zhí)行驗收標(biāo)準(zhǔn)，也可以用于其它水樣。

2. 本方案符合美國調(diào)查和探測標(biāo)準(zhǔn)，通過了美國EPA認(rèn)證。本方案以的專家團所提供的實驗室試驗為基礎(chǔ)。專家團負責(zé)提供一種用于回收與探測原生動物改進草案，能夠通過最小的附加研究來檢測和實現(xiàn)。

3. 本方案不用于鑒定隱孢子蟲或賈第鞭毛蟲種類或其它原寄主種類，也不能確定探測到的卵囊和包囊的活性及其侵染性。

4. 本方案應(yīng)由精于通過過濾，免疫磁分離和免疫檢驗化驗對隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲進行探測的人員使用。第22.2部分把這類人定義為分析員。不熟悉通過本方案技術(shù)對環(huán)境樣本進行分析的試驗室應(yīng)獲得使用水樣過濾技術(shù)、免疫磁分離和單克隆抗體熒光抗體著色，利用明場和差分干涉相襯（DIC）顯微鏡檢驗法對生物微粒微觀檢驗的技術(shù)。

二、主要實驗環(huán)節(jié)

1. 通過水樣過濾，把卵囊、包囊和外來物質(zhì)留在過濾器上。

2. 洗脫與分離

2.1 過濾器上的物質(zhì)經(jīng)過洗脫，洗脫物通過離心分離作用使卵囊和包囊成為球形，同時分離出的上清液被吸取。

2.2 卵囊和包囊被與抗隱孢子蟲和抗賈第鞭毛蟲抗體結(jié)合的磁珠附加裝置磁化。通過使用磁體，磁化后的卵囊和包囊從其它物質(zhì)中分離，其它物質(zhì)被清除。接著，磁珠聯(lián)合體從卵囊和包囊中分離。

3. 計數(shù)

3.1 卵囊和包囊在穴槽載玻片上被磁熒光標(biāo)記的單性抗體和4'，6-Diamidino-Phenylindole(DAPI)溶液著色。用熒光和差分干涉相襯（DIC）顯微鏡檢驗法對著色樣本進行檢驗。

3.2 通過仔細觀察每一個載玻片，對符合隱孢子蟲卵囊和包囊大小，外形和熒光特性的對象進行定性分析。

3.3 通過計算載玻片上被確定為卵囊和包囊的對象來進行定性分析。

3.4 通過使用再現(xiàn)校準(zhǔn)和過濾，免疫磁分離，著色和顯微鏡檢驗系統(tǒng)來保證質(zhì)量。

（以上流程詳見附件“隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲檢測方法講稿"）

本系統(tǒng)采用《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》GB/T 5750.12-2006，

同時也符合美國EPA第1622和1623號方法，

英國DWI（飲用水監(jiān)察署）第1524號方法，

ISO（國際標(biāo)準(zhǔn)化組織）第15553號方法。

Envirochek®及Envirochek HV膠囊式取樣過濾器

用于從水源水或成品水中濃縮、回收隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊

簡單易用，過濾支架或洗提裝置無需裝配，也無需清洗。

 可同時處理多個樣本，從而節(jié)約時間。

一次性使用的設(shè)計，消除交叉污染導(dǎo)致的假陽性可能。

對于目標(biāo)有機體的回收率通常高于70%。

利用孔徑為1μm的濾膜，99%截留收集隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲，從而消除了假陰性可能。

更高的使用安全性。作為自主式膠囊式過濾器，意味著過濾元件無需處理，也不需分割。

序列編碼，以供追蹤。

 Envirochek HV膠囊式過濾器均已通過完整性測試。

應(yīng)用：Envirochek膠囊式取樣過濾器

有效過濾面積：1,300 cm2

外形尺寸

長度：21.6厘米（8.5英寸）

直徑：6.1厘米（2.4英寸）

入口/出口連接

12.7 mm (1/2 in.) 倒刺直軟管

洗提能力

下限為127mL